Vad är en rekombinant plasmid?

En plasmid är en cirkulär bit av DNA som finns i många bakterier.Det mest anmärkningsvärda inslaget hos plasmider är att de replikerar oberoende av värdens huvudsakliga DNA.Ofta används en plasmid vid rekombinant kloningsteknik för att klona nyisolerade gener.Det är också mycket vanligt att använda en rekombinant plasmid för att uttrycka stora mängder av en känd gen för att erhålla RNA eller protein från det.Sådan rekombinant genuttryck har varit oundgänglig för bioteknikindustrin.

Rekombinanta plasmider utvecklades först i laboratoriets råtta i bakterievärlden, Escherichia coli .Många andra typer av bakterier kan innehålla sådana plasmider.Dessa bitar av självreplikerande DNA kan överföra naturligt mellan olika typer av bakterier.Trots detta var det ibland svårt att införa de rekombinanta plasmiderna i andra typer av bakterier.

Det primära förfarandet för att införa DNA i andra celler kallas transformation, där bakterierna behandlas med kemikalier som gör dem mer benägna att ta ut främmande DNA.En annan teknik involverar chockerande bakterier med en elektrisk ström.Detta kallas elektroporation.

Skälen för att skapa en rekombinant plasmid varierar.Ofta när DNA först isoleras från en viss vävnad eller organisme, förvandlas det till plasmider för att skapa ett bibliotek.Sedan kan DNA extraheras från enskilda kolonier.Därefter kan de screenas genom DNA -sekvensering för att bestämma vilka typer av gener som finns, om sekvenserna finns i en databas.Ibland klonas gener med okända funktioner.

I andra fall är genprodukten välkänd, men forskarna vill uttrycka stora mängder av det för ytterligare studier.Genen kan klonas i rekombinanta plasmider som är överuttrycksvektorer.De är utformade särskilt för att producera stora mängder RNA eller protein.Detta har varit särskilt värdefullt för rekombinanta humana proteiner, som tidigare ofta bara var tillgängliga från kadavrar, vilket gör det mycket svårt att studera funktionen hos en viss gen.

Flera faktorer är involverade i att konstruera en plasmid som kan användas vid molekylkloning.Plasmiden måste ha en valbar markör.Detta gör det möjligt att välja en cell med genen.Normalt sett utgör populationen av celler som saknar genen med markören i hög grad mängden celler som bär den.I allmänhet har en rekombinant plasmid resistens mot ett antibiotikum eller kan växa i frånvaro av en viss aminosyra.

En sådan plasmid behöver ett replikations ursprung så att det kan börja syntetisera dess rekombinanta DNA.Dessutom kräver en rekombinant plasmid en uppsättning speciella sekvenser för att tillåta ett begränsningsenzym för att klyva DNA för att tillåta en gen att sättas in i kloningvektorn.Det finns ett stort antal restriktionsenzymer som är mycket specialiserade för specifika DNA -sekvenser som måste vara närvarande där genen startar och slutar.

Traditionella stammar av bakterier har använts för DNA -kloning i årtionden.Dessutom finns det nya satser som använder speciellt konstruerade bakteriestammar för att underlätta överuttryck av genprodukten.De kombinerar tekniken för kloning av en gen med en metod som möjliggör enkel rening av proteinet uttryckt från genen när den har klonats in i den rekombinanta plasmiden.